FISH PCR NGS 这些主流伴随诊断技术的区别到底在哪里？

发布日期：2024-08-28浏览次数：

FISH PCR NGS 这些主流伴随诊断技术的区别到底在哪里？ 随着基因组学的发展与广泛应用，荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）、聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）、高通量测序（next-generation sequencing，NGS）这三种伴随诊断技术逐渐成为精准医疗、遗传学研究和疾病诊断中不可或缺的角色，极大地推动了遗传病诊断、肿瘤基因检测和个性化医疗的发展。那这几种检测方式到底有何异同？同样是检测基因异常突变，为何样本类型、价格、检测周期能差那么多？本期，就让我们一起来领教一下这几个“基因侦探”的独门技艺吧。 FISH：荧光标记下的染色体秘密 FISH是一种分子生物学技术，用于检测特定DNA或RNA序列的存在。它的原理是利用带有荧光的标记探针与目标DNA或RNA序列进行互补配对，通过荧光显微镜观察来确定目标序列的位置和数量。FISH技术在临床上主要用于染色体分析，如产前诊断、肿瘤诊断和遗传病分析等。它的优点包括高度的特异性和定位准确性，能够检测到基因扩增、缺失及重排等情况，而且实验周期短、能迅速得到结果。不过，FISH技术的局限性在于它通常只能检测有限的染色体或基因，且对样本的要求较高，可能受到样本质量和检测条件的限制。 PCR：扩增的魔法 PCR是一种用于放大扩增特定 DNA 片段的分子生物学技术，可以看作是生物体外的特殊 DNA 复制，其最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。在存在 DNA模板、引物、dNTPs、适当缓冲液 (Mg2+) 的反应混合物中，在热稳定 DNA 聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的核酸片段进行扩增，这种扩增是以模板 DNA与引物之间的变性、退火、延伸三步反应为一个周期，循环进行，使目标 DNA 片段得以扩增。 一代PCR 不过一代PCR也有一定的的局限性： ①一代 PCR 采用的核酸燃料对实验人员及环境造成较大伤害； ②PCR 完成之后开盖检测易污染造成假阳性结果； ③检测耗时长且操作麻烦易出错； ④只能做定性检测。 因此，二代PCR才是目前国内PCR技术主流 二代PCR即荧光定量PCR技术（Real-Time PCR），也叫做 qPCR，是指通过应用荧光染料或荧光标记的特异性探针(如 Taqman Probe)，在 PCR 反应体系中加入荧光基团对聚合酶链反应产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合软件对荧光信号进行分析，实现基因检测的定性和定量分析。目前，qPCR常用于传染病病原体检测、疾病耐药基因研究、药物疗效考核、遗传疾病诊断等。 二代PCR 随着 PCR 系统的进一步发展已经对检测，一种具备较高灵敏度和特异性的数字PCR 技术开始被广泛应用于肿瘤临床检测和科学研究中。数字PCR（Digitai PCR， dPCR）是一种新兴的核酸检测技术，通过将每个核酸分子分配到一个独立的空间内，避免选择性扩增对扩增结果的干扰，可实现核酸模板绝对定量、稀有突变检测、拷贝数变异、DNA 甲基化、基因重排等检测功能。由于数字 PCR 可以实现直接定量分析，被称为第三代 PCR。 三代PCR 标准PCR反应体系经过微滴发生后，分配到约~30000个微滴中，每个微滴包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子（DNA模板），实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。 在医药方向，数字PCR常用于肿瘤研究、传染性疾病研究（细菌、真菌、病毒、支原体）、NIPT、器官移植监控、干细胞研究、移植监控、药物基因组学开发、生物标志物开发、药物生产质控等。 一、二、三代 PCR 的技术优劣 NGS：海量数据的解读者 NGS（高通量测序）也称为二代测序，是一种能够同时对大量DNA分子进行并行测序的技术。它通过模板 DNA 分子的化学修饰，将其锚定在纳米孔或微载体芯片，利用碱基互补配对原理，在 DNA 聚合酶链反应或 DNA 连接酶反应过程中，通过采集荧光标记信号或化学反应信号，实现碱基序列的解读，一次性可完成几十万至上百万序列的测定。与传统的Sanger测序相比，NGS具有更高的通量和更低的成本，能够快速生成海量的基因组数据。 NGS的核心原理是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，在基因组学、转录组学、表观遗传学等研究领域中发挥着重要作用，尤其在疾病关联研究、个性化医疗和癌症诊断等方面展现出巨大的潜力。目前NGS主要应用在肿瘤早筛与诊断、生殖遗传、感染病原体确诊与耐药检测、科学研究等。 结语 在比较FISH、PCR和NGS这三种技术时，我们可以看到它们各自的优势和局限性。FISH技术在定位和分析染色体异常方面表现出色，但其检测范围有限；PCR技术适用于快速扩增特定DNA片段，但在复杂样本中的应用面临挑战；NGS技术则在数据产出量和多样性分析方面具有明显优势，但需要更复杂的后期数据处理。在实际应用中，选择哪一种技术往往取决于具体的检测需求、样本情况和可用资源。随着技术的不断发展和整合，未来的分子诊断可能会更多地依赖于这些技术的组合和优化，以达到更高的准确性和效率。